概述：QT High-Fidelity DNA Polymerase超保真DNA聚合酶，是经蛋白质工程改造的DNA聚合酶，兼具快速和高保真度的特性，可以在多种PCR反应中使用，在复杂模板条件下也有良好的表现。QT High-Fidelity DNA Polymerase聚合酶合成DNA的速率为2-4 kb/min，其保真度是普通Taq DNA聚合酶的50倍，是Pfu DNA聚合酶的6倍。QT High-Fidelity DNA Polymerase具有5´→3´DNA聚合酶活性和3´→5´核酸外切酶活性，扩增产物为平末端。

来源：携带有QT High-Fidelity DNA Polymerase基因的E.coli菌株。

应用：PCR；克隆；长片段扩增或困难模板扩增；高通量PCR。

贮存条件：20mM Tris-HCl (pH7.4 @25°C)，100mM KCl，0.1mM EDTA，0.5%Tween 20，0.5% IGEPAL® CA-630，200μg/ml BSA，1mM DTT和50%甘油(V/V)。

反应条件：50μl反应体系中含有：1×QT Reaction buffer A或B缓冲液，DNA模板，0.5μM引物，200μM dNTPs (不随酶附赠)，3% DMSO (可选) 和1U QT High-Fidelity DNA Polymerase。

活性定义：1单位指在74°C条件下，反应30分钟能使10 nmol的dNTPs掺入酸不溶性沉淀物所需的酶量。

质量控制：

核酸内切酶活性：50μl反应体系中，10 U本酶与0.2mM dNTPs和1μg的pUC19质粒于37°C温育4小时，<10%的pUC19质粒由超螺旋变为缺刻状态。

7.5 kb基因组DNA PCR扩增：50μl反应体系，1×QT Reaction buffer A缓冲液，50ng基因组DNA，1U QT High-Fidelity DNA Polymerase，200μMdNTPs和1μM引物，30个循环PCR扩增出7.5 kb目的片段。

20 kb λDNA PCR扩增：50μl反应体系，1×QT Reaction buffer A缓冲液，10ng λDNA，1U QT High-Fidelity DNA Polymerase，200μM dNTPs和1μM引物，22个循环PCR扩增出20 kb目的片段。

PCR扩增指南:

1. PCR反应体系的建立：

建议将所有反应组分置于冰上，所有的试剂使用前都要充分混匀。由于1U QT High-Fidelity DNA Polymerase具有3´→5´核酸外切酶活性，在无dNTPs条件下会降解引物，所以1U QT High-Fidelity DNA Polymerase应该最后加入到反应体系中。

a. 对于复杂模板或高GC含量的模板，请使用5×QT Reaction buffer B缓冲液。

b. PCR反应体系中引物终浓度的范围为0.2-1.0μM，推荐0.5μM。

c. 为了减少移液误差，可以使用1×QT Reaction buffer A或B缓冲液稀释适量的QT High-Fidelity DNA Polymerase以便于吸取。

1.1 模板：50 μl PCR反应体系中DNA模板的建议用量如下：

低复杂度模板 (如：质粒，λDNA，BAC DNA) 1pg-10ng；高复杂度模板 (如：基因组DNA) 50-250ng。

1.2 引物：使用QT High-Fidelity DNA Polymerase时，每条引物的终浓度为0.2-1.0μM，建议用量是0.5μM。

1.3 Mg2+和添加物：由于QT High-Fidelity DNA Polymerase是一种镁离子依赖型酶，故Mg2+浓度对其有着关键作用。1×QT Reaction buffer A和B缓冲液中Mg2+的终浓度为1.5 mM。过量的Mg2+能稳定DNA双链结构，阻止DNA完全变性，防止由于引物非正确结合模板位点引起的假阳性。Mg2+浓度不足则会导致PCR的产量降低。最佳Mg2+浓度应还受总dNTP的浓度、特定模板以及样品缓冲液成分影响。如果引物或模板中含有螯合剂 (如EDTA) 时，则应提高Mg2+的浓度。如需要对Mg2+浓度进行优化，可以使用MgCl₂按0.5mM的浓度梯度逐步调整。

对于复杂模板，如高GC含量的序列和带有复杂二级结构的序列，可以加入DMSO (随酶提供) 等添加物以提高反应效率。建议DMSO的终浓度为3%，也可以按2%的浓度递增优化。由于DMSO可以降低引物的Tm值，因此如果DMSO浓度很高，则需要降低退火温度。

1.4 dNTPs的浓度：反应体系中dNTPs的浓度一般为每种200μM。在使用QT High-Fidelity DNA Polymerase时，不推荐使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板。

1.5 QT High-Fidelity DNA Polymerase的浓度：QT High-Fidelity DNA Polymerase的推荐使用浓度是20 U/ml (1 U/50 μl反应体系)。如果需要，QT High-Fidelity DNA Polymerase的用量可以在10-40 U/ml (0.5-2 U/50 μl反应体系) 之间优化。QT High-Fidelity DNA Polymerase的用量不应超过2 U/50 μl反应体系，尤其当扩增片段的长度大于5 kb时。

1.6 缓冲液：当进行高保真扩增时，QT Reaction buffer A缓冲液是默认的推荐缓冲液。对于复杂模板 (高GC含量或有复杂二级结构)，建议使用QT Reaction buffer B。

2. PCR循环条件的设定：

QT High-Fidelity DNA Polymerase PCR循环的变性 (98°C) 和退火温度较高，有别于常见的PCR循环，在使用时请注意。

2.1 变性：对于大多数模板的推荐初始变性温度是98°C，变性时间是30 s。对于需要延长变性时间的模板，初始变性时间可以增加到3分钟。在PCR循环过程中，变性时间越短越好，对于大多数模板，通常在98°C的变性时间是5-10 s。

2.2 退火：当使用QT High-Fidelity DNA Polymerase时，引物的Tm需要采用nearest-neighbor方法来计算。

QT High-Fidelity DNA Polymerase具有稳定引物和模板杂交的性能，PCR循环条件中退火温度设定的基本的原则是，当引物长度大于20 nt时，退火温度在最低Tm的基础上以Tm+3°C退火10-30 s；当引物长度小于或等于20 nt时，退火温度为引物最低的Tm。如果需要，可以建立一个温度梯度去寻找引物和模板结合最适温度，这个梯度温度从最低的Tm逐步提升到模板延伸温度。对于Tm高的引物可以使用两步法PCR (详见下文)。

2.3 延伸：延伸过程可以在72°C中进行，延伸时间取决于扩增片段的长度和模板复杂性，复杂性较低时可用15秒/kb的延伸时间；复杂性较高的基因组DNA模板，延伸时间则应为30秒/kb。对于有些cDNA模板，延伸时间可增加到40秒/kb。

2.4 循环数：通常25-35个循环可以产生足够的PCR产物。

2.5 两步法PCR：当引物的退火温度≥72°C时建议使用两步法进行PCR扩增。常规的两步法PCR热循环条件如下：

2.6 PCR产物：使用QT High-Fidelity DNA Polymerase扩增的产物是平末端，如果产物直接用于克隆，建议使用平末端连接。如果需要进行T/A克隆，在加A之前需要纯化DNA，因为QT High-Fidelity DNA Polymerase会降解产生的突出端。为平末端模板加A可以用Taq DNA聚合酶或者Klenow片段 (3´→5´ exo-)。